E-kniha: Metodologie předklinického a klinického výzkumu -- v metabolismu, výživě, imunologii a farmakologii – Zdeněk Zadák; Jaroslav Květina

Děkujeme za podporu publikace firmám:

Upozornění

Všechna práva vyhrazena.

Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována a šířena v papírové,

elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele.

Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.

Galén

Na Bělidle 34, 150 00 Praha 5

www.galen.cz

© Galén, 2012

Zdeněk Zadák, Jaroslav Květina et al. Metodologie předklinického a klinického výzkuMu

v metabolismu, výživě, imunologii

a farmakologii

Galén

Hlavní autoři a pořadatelé

prof. MUDr. Zdeněk Zadák, CSc.

Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice, Hradec Králové,

Centrum pro výzkum a vývoj, Klinika gerontologická a metabolická

prof. RNDr. Jaroslav Květina, DrSc., dr. h. c.

Ústav experimentální biofarmacie, společné pracoviště Akademie věd ČR a PRO.MED.CS Praha a.s.,

Hradec Králové;

Veterinární a farmaceutická univerzita, Farmaceutická fakulta, Brno, Ústav humánní farmakologie

a toxikologie

Recenzenti

prof. MUDr. Michal Anděl, CSc.

Univerzita Karlova v Praze, 3. lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Královské Vinohrady,

Praha, II. interní klinika

prof. MUDr. František Perlík, DrSc.

Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice, Praha,

Farmakologický ústav

prof. MUDr. Vladimír Teplan, DrSc.

Institut klinické a experimentální medicíny, Praha, Klinika nefrologie

Zdeněk Zadák, Jaroslav Květina et al.

METODOLOGIE PŘEDKLINICKÉHO A KLINICKÉHO VÝZKUMU

V METABOLISMU, VÝŽIVĚ, IMUNOLOGII A FARMAKOLOGII

První vydání v elektronické verzi

Vydalo nakladatelství Galén, Na Bělidle 34, 150 00 Praha 5

Editor PhDr. Lubomír Houdek

Šéfredaktorka PhDr. Soňa Dernerová

Redakční spolupráce Mgr. Michaela Naňková

Sazba Petra Veverková, DTP Galén

Určeno odborné veřejnosti

G 301021

Kniha vznikla za podpory Výzkumného záměru Fakultní nemocnice Hradec Králové MZO 00179906,

grantu MPO FI-IM5/098, grantu IGA MZ ČR NS 10528-3, grantu GAČR 305/08/0535.

Všechna práva vyhrazena.

Tato publikace ani žádná její část nesmí být reprodukovány, uchovávány v rešeršním systému

nebo přenášeny jakýmkoli způsobem (včetně mechanického, elektronického,

fotografického či jiného záznamu) bez písemného souhlasu nakladatelství.

© Galén, 2011

ISBN 978-80-7262-855-1 (PDF)

ISBN 978-80-7262-856-8 (PDF pro čtečky) Autorský kolektiv Spoluautoři doc. RNDr. Ctirad Andrýs, Ph.D. Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice, Hradec Králové, Ústav klinické imunologie a alergologie doc. PharmDr. Martin Beránek, Ph.D. Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice, Hradec Králové, Ústav klinické biochemie a diagnostiky Olga Bukačová Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Lékařská knihovna MUDr. Norbert Cibiček, Ph.D. Univerzita Palackého v Olomouci, Ústav lékařské chemie a biochemie

PhDr. Eva Čečková

Univerzita Karlova v Praze,

Lékařská fakulta v Hradci Králové,

Lékařská knihovna

prof. MUDr. Zuzana Červinková, CSc.

Univerzita Karlova v Praze,

Lékařská fakulta v Hradci Králové,

Ústav fyziologie

RNDr. Zdeněk Drahota, DrSc.

Akademie věd ČR, Praha,

Fyziologický ústav

PharmDr. Miloslav Hronek, Ph.D.

Univerzita Karlova v Praze,

Farmaceutická fakulta v Hradci Králové,

Katedra biologických a lékařských věd Hlavní autoři a pořadatelé prof. MUDr. Zdeněk Zadák, CSc. Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice, Hradec Králové, Centrum pro výzkum a vývoj, Klinika gerontologická a metabolická prof. RNDr. Jaroslav Květina, DrSc., dr. h. c. Ústav experimentální biofarmacie, společné pracoviště Akademie věd ČR a PRO.MED.CS Praha a.s., Hradec Králové; Veterinární a farmaceutická univerzita, Farmaceutická fakulta, Brno, Ústav humánní farmakologie a toxikologie

VI

Metodologie klinického výzkuMu

MUDr. Radomír Hyšpler, Ph.D. Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice, Hradec Králové, Klinika gerontologická a metabolická Mgr. Soňa Janáčková Fakultní nemocnice, Hradec Králové, Centrum pro výzkum a vývoj MUDr. Petr Kocna, Ph.D. Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice, Praha, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky prof. RNDr. Jan Krejsek, CSc. Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice, Hradec Králové, Ústav klinické imunologie a alergologie prof. MUDr. Jiřina Martínková, CSc. Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Ústav farmakologie

prof. MUDr. Terezie Pelikánová, DrSc.

Institut klinické a experimentální

medicíny, Praha, Centrum diabetologie

MVDr. Stanislav Špelda

Střední odborná škola veterinární,

Hradec Králové

RNDr. Alena Tichá, Ph.D.

Univerzita Karlova v Praze,

Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice,

Hradec Králové, Klinika gerontologická

a metabolická

MUDr. Roman Trubač

B. Braun Medical s.r.o., Praha

RNDr. Petr Žďánský, CSc.

Fakultní nemocnice, Hradec Králové,

Klinika gerontologická a metabolická

doc. MUDr. Pavel Živný, CSc.

Univerzita Karlova v Praze,

Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice,

Hradec Králové, Ústav klinické

biochemie a diagnostiky Recenzenti prof. MUDr. Michal Anděl, CSc. Univerzita Karlova v Praze, 3. lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Královské Vinohrady, Praha, II. interní klinika prof. MUDr. František Perlík, DrSc. Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice, Praha, Farmakologický ústav prof. MUDr. Vladimír Teplan, DrSc. Institut klinické a experimentální medicíny, Praha, Klinika nefrologie

obsAh

VII

obsah

Předmluva ........................................................................................................................................... XV

I. INFORMAČNÍ ZDROJE PRO UPŘESŇOVÁNÍ VÝZKUMNÉ HYPOTÉZY

A VÝZKUMNÉHO PROJEKTU

1. knihovnické služby a informační zdroje ..................................................................... 2

eva Čečková, olga bukačová, soňa Janáčková

1.1. Služby knihoven ............................................................................................................... 2

1.2. Informační zdroje ............................................................................................................. 3

1.2.1. Informační prameny primární .......................................................................... 3

1.2.2. Informační prameny sekundární – bibliografie, rejstříky,

katalogy, databáze ................................................................................................ 3

1.2.2.1. Elektronické informační zdroje ....................................................... 4

1.2.2.2. E-knihy ............................................................................................... 4

1.2.2.3. Databáze ............................................................................................ 5

1.3. Impakt faktor, citační index a Hirschův index ......................................................... 6

1.3.1. Impakt faktor ........................................................................................................ 6

1.3.1.1. Kde a jak hledat impakt faktor ........................................................ 6

1.3.2. Citační index ......................................................................................................... 7

1.3.2.1. Kde a jak hledat citovanost .............................................................. 8

1.3.3. Hirschův index ...................................................................................................... 8

1.3.3.1. Kde a jak hledat Hirschův index ..................................................... 9

1.4. Jak citovat .......................................................................................................................... 9

1.5. Tvorba rešerší ................................................................................................................. 10

1.6. Přehled nejužívanějších databází v lékařství ........................................................ 12

II. ETIcKO-MORÁlNÍ ZÁSADY V BIOMEDIcÍNSKÝcH VÝZKUMEcH

2. Principy vědeckosti a vědecké etiky v biomedicínském výzkumu .............. 16

Jaroslav květina

3. etické aspekty klinického výzkumu ........................................................................... 20

Petr Žďánský

4. legislativní předpoklady provádění klinických hodnocení léčiv ................... 30

Roman trubač

VIII

Metodologie klinického výzkuMu

5. Podmínky experimentů využívajících animální modely ..................................... 39

stanislav Špelda

5.1. Experimentální modely ................................................................................................ 40

5.2. Animální modely ............................................................................................................ 41

5.3. Právní normy ve vztahu k ochraně pokusných a laboratorních zvířat .......... 45

5.4. Realizační podmínky pro použití zvířat v experimentální práci ....................... 48

5.5. Kontrolní instituce ......................................................................................................... 51

III. VYBRANÉ METODOlOGIE PRO PŘEDKlINIcKÉ VÝZKUMNÉ FÁZE

A JEJIcH KlINIcKO-VÝZKUMNÉ APlIKAcE

6. Molekulární biologie v biomedicínském výzkumu .............................................. 54

Martin beránek

6.1. Analytické přístupy používané k izolaci nukleových kyselin ........................... 55

6.2. Amplifikační metody pro DNA analýzu in vitro ..................................................... 57

6.3. Elektroforéza nukleových kyselin ............................................................................. 62

6.4. Hybridizace nukleových kyselin se specifickou sondou ................................... 63

6.5. Analýza polymorfismu délky restrikčních fragmentů ........................................ 64

6.6. Klonování DNA ................................................................................................................ 65

6.7. Sekvenování DNA .......................................................................................................... 66

6.8. Projekt Lidský genom .................................................................................................. 68

6.9. Studium exprese genů ................................................................................................. 68

6.10. Studium interakcí mezi DNA a proteiny .................................................................. 70

6.11. Geneticky modifikované organismy ......................................................................... 70

6.12. Klonování organismů .................................................................................................... 71

6.13. Genová terapie ................................................................................................................ 72

6.14. Význam molekulární biologie pro současný biomedicínský výzkum

a zdravotnictví ................................................................................................................. 73

6.15. Specifické rysy biomedicínského výzkumu v oblasti molekulární biologie ... 74

6.16. Etické problémy molekulární biologie v biomedicínském výzkumu ............. 75

7. využití izotopů biogenních prvků v metabolickém výzkumu .......................... 77

Radomír hyšpler

7.1. Izotopy vodíku ................................................................................................................. 78

7.2. Izotopy uhlíku .................................................................................................................. 79

7.3. Izotopy kyslíku, dusíku, fosforu a síry ..................................................................... 79

7.4. Rozdíly, výhody a nevýhody využití stabilních a radioaktivních izotopů ...... 80

7.5. Analytika stabilních a radioaktivních izotopů ........................................................ 81

7.6. Bezpečnost stabilních izotopů .................................................................................. 83

7.7. Výpočty v tracerových studiích ................................................................................. 84

7.8. Základní metodologické dělení tracerových studií ............................................. 84

7.9. Vyšetřovací metody založené na poměru

13

CO

2

/

12

CO

2

ve vydechovaném

vzduchu ............................................................................................................................ 85

obsAh

IX

8. Metody měření buněčného dýchání, hodnocení funkce mitochondrií ...... 89

zuzana Červinková, zdeněk drahota

8.1. Struktura a funkce mitochondrií ............................................................................... 89

8.2. Oxygrafické hodnocení mitochondriálního systému oxidativní fosforylace ..... 91

8.3. Měření spotřeby kyslíku oxygrafem OROBOROS ............................................... 93

8.4. Respirace izolovaných buněk inkubovaných v extracelulárním

a intracelulárním médiu ............................................................................................... 94

8.5. Respirace izolovaných hepatocytů permeabilizovaných digitoninem .......... 97

9. Mikrodialýza a její využití v experimentálním a klinickém výzkumu ........... 100

norbert cibiček, Pavel Živný

9.1. Historie mikrodialýzy .................................................................................................. 100

9.2. Princip mikrodialyzační techniky ............................................................................ 101

9.3. Složky mikrodialyzačního systému ........................................................................ 103

9.4. Výhody a omezení mikrodialýzy .............................................................................. 105

9.5. Metodologické aspekty mikrodialýzy .................................................................... 107

9.5.1. Sonda (geometrie, materiály, povrch) .......................................................... 107

9.5.2. Perfúzní médium (složení, teplota, rychlost průtoku) ............................. 107

9.5.3. Trubicový systém (interakce s analyty, průsvit, délka,

hydrostatický tlak) ........................................................................................... 108

9.5.4. Tkáňové poškození .......................................................................................... 108

9.5.5. Analytické podmínky ...................................................................................... 109

9.5.6. Výtěžek sondy .................................................................................................... 109

9.5.6.1. Definice (absolutní, relativní, in vitro, in vivo) .......................... 109

9.5.6.2. Faktory ovlivňující výtěžek .......................................................... 110

9.5.6.3. Metody kalkulace výtěžku

(a intersticiálních koncentrací látek) in vivo ..................................... 112

9.5.7. Statistická analýza dat ..................................................................................... 114

9.6. Využití mikrodialýzy v základním a klinickém výzkumu .................................. 115

9.6.1. Obecné aplikace .................................................................................................. 115

9.6.1.1. Transmembránové procesy .......................................................... 115

9.6.1.2. Metabolismus (a účinek látek) ve tkáni ...................................... 115

9.6.1.3. Krevní průtok ve tkáni (mikrocirkulace) ................................... 116

9.6.2. Orgánové aplikace ............................................................................................ 116

9.6.2.1. Mozek ............................................................................................. 116

9.6.2.2. Kosterní sval a myokard ............................................................... 117

9.6.2.3. Gastrointestinální trakt ................................................................ 118

9.6.2.4. Tuková tkáň ................................................................................... 119

9.6.2.5. Plíce ................................................................................................ 119

9.6.2.6. Krev ................................................................................................ 119

9.6.2.7. Ledvina ........................................................................................... 120

9.6.2.8. Kůže ................................................................................................ 120

9.6.2.9. Kost ................................................................................................. 120

9.6.2.10. Oko ................................................................................................. 121

9.6.2.11. Nádory ........................................................................................... 121

9.6.2.12. Mléčná žláza a další tkáně ............................................................ 121

9.7. Závěr ................................................................................................................................ 121

X

Metodologie klinického výzkuMu

10. Analýza dechu v experimentálním a klinickém výzkumu ............................... 123

Alena tichá, Petr kocna 10.1. Přehled metod využívajících analýzu vydechovaného vzduchu ................... 123

10.2. Problematika odběru vzorku vydechovaného vzduchu ................................... 124

10.2.1. Vzorkování vydechovaných plynů ................................................................ 124

10.2.2. Odběr a uchování vzorku ................................................................................ 125

10.2.3. Odběr vydechovaného vzduchu za použití odběrových vaků ................. 126

10.3. Analytické přístroje užívané při dechových testech obecně ......................... 126

10.4. Jednotlivé metody a jejich vlastnosti a analytická instrumentace ............... 129

10.4.1. Stanovení vodíku ve vydechovaném vzduchu ............................................ 129

10.4.2. Stanovení methanu ve vydechovaném vzduchu ......................................... 130

10.4.3. Stanovení isoprenu ve vydechovaném vzduchu ......................................... 134

10.4.4. Dechové testy se substrátem značeným

13

C ................................................. 138

10.5. Obecná úskalí při interpretaci výsledků dechových testů .............................. 141

11. hodnocení kvality rostlinných bílkovin

v experimentálním zvířecím modelu ........................................................................ 142

Alena tichá, Radomír hyšpler

11.1. Význam biologické hodnoty proteinů .................................................................... 142

11.2. Dusíková bilance .......................................................................................................... 145

11.3. Stanovení nutriční kvality proteinů experimentálně ......................................... 145

11.3.1. Příklad protokolu experimentu ..................................................................... 146

11.3.2. Popis experimentu ............................................................................................ 146

11.3.3. Časový rozvrh experimentu a odběry biologického materiálu ............... 146

11.3.4. Vyhodnocení experimentu a závěr ................................................................ 148

12. Předklinické fáze lékových výzkumů ....................................................................... 152

Jaroslav květina 12.1. Principy a zdroje farmakoterapeutických inovací ............................................. 152

12.2. Farmakologické předklinické testy ........................................................................ 156

12.2.1. Výzkum léčiva v léčebné praxi dosud zcela nepoužitého ......................... 157

12.2.2. Výzkum lékové kopie (lékového generika) .................................................. 157

IV. VYBRANÉ METODOlOGIE PRO KlINIcKÉ STUDIE

13. Přehled základních metod a metodických přístupů používaných

v klinicko-farmakologickém výzkumu ..................................................................... 184

Jiřina Martínková

13.1. Metody a metodické přístupy používané v etapách předregistračních

a poregistračních ......................................................................................................... 184

13.1.1. Charakteristika etap ........................................................................................ 184

13.1.2. Metody a metodické přístupy klinicko-farmakologických etap

předregistračních a poregistračních ............................................................. 190

13.1.2.1. Volba dávky a dávkovacího režimu k navození žádoucího

terapeutického účinku a bezpečnosti využití léčivého přípravku .... 190

13.1.2.2. Metody hodnocení odpovědi na podání léčiva .......................... 192

13.1.2.3. Interindividuální variabilita v odpovědi ..................................... 194

obsAh

XI

13.1.2.4. Biomarkery, jejich vývoj a využití ............................................... 197

13.1.2.5. Nežádoucí účinek. Metody hodnocení a evidence .................... 199

13.1.2.6. Genetický polymorfismus. Genotyp, fenotyp ............................ 200

13.2. Metody k individualizaci farmakoterapie ............................................................. 204

13.2.1. Metoda nomogramů ........................................................................................ 204

13.2.2. Terapeutické monitorování ............................................................................ 204

13.3. Metody k vyhodnocení celospolečenského významu léčiva ......................... 206

13.4. Specifické metody klinického hodnocení ............................................................ 207

13.5. Informace o léčivu (viz též kap. 4) .......................................................................... 208

13.6. Nové směry interdisciplinárního vývoje farmakologických metod v klinice ... 208

14. imunologické metody v klinickém výzkumu ........................................................ 211

ctirad Andrýs, Jan krejsek

14.1. Buňkami zprostředkovaná imunita ........................................................................... 211

14.1.1. Buněčný substrát imunitní odpovědi ........................................................... 211

14.1.2. Izolace buněčných populací ........................................................................... 212

14.1.2.1. Gradientové izolace ...................................................................... 212

14.1.2.2. Imunomagnetická separace buněk .............................................. 213

14.1.2.3. Separace buněk pomocí průtokové cytometrie ......................... 213

14.1.3. Identifikace buněčných populací – cytoimunofluorometrie ................... 214

14.1.3.1. Monoklonální protilátky, CD klasifikace a imunofluorescenční

techniky .......................................................................................... 214

14.1.3.2. Průtoková cytometrie – principy fungování .............................. 214

14.1.3.3. Průtoková cytometrie – aplikace ................................................. 216

14.2. Kultivace buněk imunitního systému .................................................................... 218

14.2.1. Základní charakteristika kultivačních metod in vitro .............................. 218

14.3. Stanovení solubilních markerů souvisejících s imunitním systémem ........ 219

14.3.1. Metoda ELISA ................................................................................................... 219

14.3.2. Multiplexové analýzy ....................................................................................... 220

14.3.2.1. Metoda proteinových (antibody) arrays ...................................... 221

14.3.2.2. Metoda založená na luminex technologii .................................... 222

14.3.3. ELISPOT analýza .............................................................................................. 223

14.4. Proteomika ..................................................................................................................... 223

V. VÝBĚR VÝZKUMNÝcH METOD V METABOlISMU A VÝŽIVĚ

15. obecné přístupy k výzkumu v metabolismu a výživě ...................................... 228

zdeněk zadák

15.1. Studie in vitro a animální in vivo v metabolismu a výživě ................................ 228

15.2. Studie in vitro v metabolismu a výživě .................................................................. 228

15.3. Modely v metabolismu a výživě in vivo ................................................................. 229

15.4. Použití experimentálních diet v metabolismu a výživě in vivo ....................... 230

15.5. Výživové studie u člověka ......................................................................................... 230

15.6. Epidemiologické nutriční studie ............................................................................. 231

XII

Metodologie klinického výzkuMu

16. Metody měření složení těla v nutričním výzkumu .............................................. 235

zdeněk zadák 16.1. Složení lidského těla na úrovni molekul a makromolekul ............................... 236

16.2. Metody měření skladby těla ..................................................................................... 237

16.3. Měření netukové a tukové hmoty těla pomocí stanovení

celotělového draslíku ................................................................................................. 239

16.4. Využití zobrazovacích metod a bioimpedance ke stanovení skladby těla .... 240

16.4.1. Duální rentgenová absorpce .......................................................................... 240

16.4.2. Výpočetní tomografie a magnetická rezonance ......................................... 241

16.5. Stanovení skladby těla pomocí bioelektrické impedance .............................. 241

16.6. Biochemické a metabolické metody měření svalové hmoty .......................... 243

16.6.1. Stanovení svalové hmoty pomocí exkrece kreatininu ............................... 243

16.6.2. Určení množství svalové hmoty stanovením methylhistidinu v moči ..... 243

17. Antropometrické metody a jejich využití ke stanovení složení těla ............ 244

Miloslav hronek 17.1. Tělesná výška ................................................................................................................ 244

17.2. Tělesná hmotnost ........................................................................................................ 245

17.3. Hmotnostně-výškové indexy ..................................................................................... 245

17.3.1. Body mass index – index tělesné hmotnosti ............................................... 245

17.3.2. Brockův index ................................................................................................... 246

17.3.3. Rohrerův index ................................................................................................. 247

17.3.4. Verdocův index ................................................................................................. 247

17.3.5. Pignetův-Varvaekův index .............................................................................. 247

17.3.6. Ponderální index .............................................................................................. 247

17.4. Množství tělesného tuku ........................................................................................... 248

17.4.1. Stanovení množství tuku měřením tloušťky kožních řas – kaliperací ..... 248

17.4.2. Stanovení množství tuku kaliperací na více místech na těle ................... 249

17.4.3. Stanovení množství tuku kaliperací na třech místech na těle ................. 250

17.5. Zhodnocení stupně malnutrice měřením tloušťky

kožní řasy m. triceps brachii .................................................................................... 251

17.6. Hodnocení rozložení tělesného tuku ..................................................................... 251

17.7. Typ obezity ..................................................................................................................... 252

17.8. Poměr pas/boky ........................................................................................................... 252

17.9. Poměr pas/stehno ....................................................................................................... 252

17.10. Střední obvod svalstva paže ..................................................................................... 253

17.11. Stanovení vrstvy podkožního tuku na principu infračervené detekce ........ 253

17.12. Stanovení vrstvy podkožního tuku ultrazvukem ................................................ 253

18. stanovení potřeby energie .......................................................................................... 255

Miloslav hronek, zdeněk zadák 18.1. Metody měření energetické potřeby ..................................................................... 256

18.1.1. Přímá kalorimetrie .......................................................................................... 256

18.1.2. Nepřímá kalorimetrie ...................................................................................... 256

18.1.3. Výpočet klidového energetického výdeje .................................................... 262

18.1.4. Výpočet utilizace nutričních substrátů ........................................................ 263

18.1.5. Zásady měření bazálního energetického výdeje nepřímou kalorimetrií .... 264

obsAh

XIII

18.1.6. Základní zásady měření klidového energetického výdeje ....................... 265

18.1.7. Izotopové metody měření energetické potřeby .......................................... 268

19. stanovení potřeby aminokyselin a bílkovin .......................................................... 270

zdeněk zadák 19.1. Stanovení bílkovinné (dusíkové) bilance .............................................................. 270

19.2. Kreatinin-výškový index a stanovení 3-methylhistidinu ................................... 271

19.3. Hodnocení biologické hodnoty proteinů .............................................................. 273

19.4. Definice a stanovení potřeby esenciálních aminokyselin ............................... 273

19.4.1. Metody stanovení množství esenciálních aminokyselin .......................... 273

19.4.2. Izotopové techniky ........................................................................................... 274

20. Metody měření příjmu potravy v klinickém experimentu ............................... 275

Miloslav hronek 20.1. Přímé měření příjmu potravy ................................................................................... 275

20.2. Záznamové metody ..................................................................................................... 276

20.3. Metoda dvojitých porcí .............................................................................................. 276

20.4. Metoda definované stravy ......................................................................................... 276

20.5. Záznam příjmu potravy vážením ............................................................................. 277

20.6. Metoda semikvantativního odhadu nutričního příjmu ..................................... 277

20.7. Anamnestické metody ............................................................................................... 279

20.8. 24hodinový záznam .................................................................................................... 280

20.9. Frekvenční nutriční anamnéza ................................................................................ 280

20.10. Výživová anamnéza ..................................................................................................... 281

20.11. Hodnocení chuťové preference ............................................................................... 281

21. Metabolické funkční testy ............................................................................................ 283

terezie Pelikánová, zdeněk zadák 21.1. Glykemický CLAMP .................................................................................................... 283

terezie Pelikánová

21.1.1. Hyperinzulinový euglykemický clamp a hyperinzulinový

izoglykemický clamp ....................................................................................... 284

21.1.1.1. Princip a provedení obecně ......................................................... 284

21.1.1.2. Technický postup .......................................................................... 284

21.1.1.3. Hodnocení ..................................................................................... 289

21.1.1.4. Interpretace výsledků a zdroje chyb ............................................ 290

21.1.2. Modifikovaný inzulinový eu/IZOglykemický clamp ................................ 291

21.1.3. Hyperglykemický clamp ................................................................................. 292

21.1.3.1. Princip a provedení obecně ......................................................... 292

21.1.3.2. Technický postup .......................................................................... 292

21.1.3.3. Hodnocení ..................................................................................... 293

21.1.4. Hypoglykemický clamp ................................................................................... 293

21.1.4.1. Princip a provedení obecně ......................................................... 293

21.1.4.2. Technický postup .......................................................................... 294

21.1.4.3. Praktický postup ........................................................................... 294

21.1.4.4. Hodnocení ..................................................................................... 295

21.1.5. Nevýhody a rizika clampových technik ....................................................... 295

XIV

Metodologie klinického výzkuMu

21.1.6. Využití clampových technik ........................................................................... 296

21.2. Metody stanovení inzulinové senzitivity/rezistence ......................................... 297

21.2.1. Inzulinová senzitivita/rezistence .................................................................. 297

21.2.2. Metody měření inzulinové senzitivity/rezistence ...................................... 299

21.2.2.1. Hyperinzulinový eu/IZOglykemický clamp ............................... 299

21.2.2.2. Minimální model FSIGT a modifikovaný FSIGT ...................... 299

21.2.2.3. Index podle Matsudy .................................................................... 301

21.2.2.4. Homeostasis model assessment ................................................... 302

21.2.2.5. Index Quicki .................................................................................. 303

21.2.2.6. Continuous Infusion of Glucose with Model Assessment ........ 304

21.2.2.7. Inzulin senzitivní test ................................................................... 304

21.2.2.8. Zkrácený inzulinový toleranční test ........................................... 305

21.2.2.9. Další způsoby testování ................................................................ 305

21.3. Technika triglyceridemického clampu .................................................................. 307

zdeněk zadák

21.3.1. Mechanismus začlenění tuků a partikulí tukové emulze bohatých

na triglyceridy do metabolických procesů .................................................. 307

21.3.2. Metoda provedení triglyceridemického clampu ........................................ 309

21.3.3. Praktické provedení triglyceridemického clampu ..................................... 310

22. nové směry ve výzkumu metabolismu a výživy ................................................. 312

zdeněk zadák 22.1. Transkriptomika ve výživě ......................................................................................... 312

22.2. Proteomika v nutričním výzkumu ........................................................................... 314

22.3. Metabolom v nutričním výzkumu ............................................................................ 315

22.4. Lipidom ve výzkumu výživy ...................................................................................... 315

Zkratky ................................................................................................................................................ 317

Rejstřík ................................................................................................................................................ 325

PředMluvA

XV

Předmluva Výzkum je slovem skloňovaným ve  všech pádech, výrazech i  významech. Je slovem zaklínacím pro mnohé aktivity, je slovem ovlivňujícím dnešní svět, je slovem slavným, nezbytným, oslavovaným, ale je i slovem zneužívaným, je slovem zatracovaným. Dnešní svět bez výzkumu jako by neexistoval. Platí to v makroekonomice i mikroekonomice, platí to samozřejmě i ve vysokém školství, platí to v medicíně a samozřejmě to vše platí také v České republice. Na kvalitních vysokých školách stoupá počet výzkumných pracovníků, daleko častěji ale počet těch, kteří se výzkumu věnují při své „normální práci“. Výkonnými pracovníky se pak mnohdy stávají studenti a studentky doktorských studijních programů. Je to dobře – mladší přicházejí s neotřelými myšlenkami a nápady, elánem a  chutí do  práce i  do  experimentu. Totéž platí v  klinické medicíně – jen málo klinických lékařů si může najít dostatek času na výzkumné aktivity. O to více je potřeba si výzkumnou roli dobře připravit, přistupovat k plánování s hlubokou znalostí nejen teorie řešeného problému, ale i  se znalostí výzkumného „řemesla“. To se často podceňuje a  zvláště mladší, nezkušení kolegové nebo naopak někteří „rutinéři“ mají tendenci přistupovat k  plánování výzkumu sice s  dobrými odbornými předpoklady, ale malou znalostí metodik a vhodných postupů. Je to jistě částečně podmíněno i tím, že chybí souhrnný, ucelený a přehledný materiál, který by všem – zkušeným i začínajícím – poskytl souhrnnou informaci.

Kniha profesorů Zadáka a Květiny a jejich spoluautorů je v tomto smyslu v českém písemnictví ojedinělá. Troufnu si říci, že je unikátní nejen svou myšlenkou, ale i provedením a vytvořením souboru, který vychází z dlouholetých zkušeností všech autorů. Zkušeností, které se navíc opakovaně prokazatelně osvědčily a potvrdily významnými vědeckými úspěchy a  získanými (a  úspěšně řešenými) granty. Je určena všem, kteří o  výzkumu uvažují, ale i  těm, kteří ve  výzkumu pracují. Prvním může ušetřit řadu omylů a počátečních neúspěchů, druhým pomůže rozšířit obzory i o metody, které nejsou zcela běžné či obecně ve výzkumu používané. Určitě je prospěšná a v dnešní době, volající po exaktnosti ve vědeckém životě, je nesmírně potřebná.

Přečetl jsem si knihu se zájmem a dlouho jsem váhal, zda mám některou z kapitol označit jako zvláště významnou či zvláště dobře připravenou. Nešlo to. Všechny jsou dobré, všechny přinášejí podstatné a dobře utříděné informace, všechny jsou zajímavé a všechny jsou potřebné. Poučil jsem se. Poučte se také.

prof. MUDr. Vladimír Palička, CSc., Dr.h.c.

„Není nic hloupějšího než předpokládat,

že počet vědeckých publikací je mírou talentu

a užitečnosti vědce“.

(John Bernal)

1

Kapitola

I.

INFORMAČNÍ ZDROJE

PRO UPŘESŇOVÁNÍ

VÝZKUMNÉ HYPOTÉZY

A VÝZKUMNÉHO

PROJEKTU

„Knihovníci rádi vyhledávají.

Všichni ostatní rádi nacházejí.“

(Roy Tennant)

1. Knihovnické služby a informační

zdroje

Eva Čečková, Olga Bukačová, Soňa Janáčková

Poznatky lidského vědění se shromažďují už od  dávných dob v  knihovnách. První doložená knihovna existovala již ve  starověku. Pro snazší orientaci v  množství knih v knihovnách vznikaly různé pořádací systémy, které se postupně během let neustále vyvíjely. V  posledních dvaceti letech se s  nárůstem vědeckých informací a  nástupem nových informačních technologií práce v  knihovnách naprosto změnila, ruční zpracování a vyhledávání literatury a informací nahradilo zpracování a vyhledávání elektronické. Vznikly nové moderní zdroje informací a nové databázové systémy, které se neustále vyvíjejí. Informace se stávají zbožím a neustále se zvyšuje i jejich cena. Vysoká cena informačních zdrojů nutí knihovny ke spolupráci a sdružování při nákupu těchto velmi drahých informací. Je tedy velmi důležité seznámit se s tím, jak tyto zdroje informací nejlépe používat a využívat.

V  zájmu čtenářů, uživatelů i  knihovníků a  informačních pracovníků je rychlé zís

kávání relevantních, finančně dostupných informací z klasických informačních zdrojů (knihy a časopisy), ale i z moderních informačních zdrojů (databáze, elektronické plnotextové časopisy, CD-ROMy). Pro uživatele informací a čtenáře knihoven je výhodné využít odborné služby, které knihovny nabízejí. Jejich cílem je poskytnutí kvalitních informačních zdrojů pro studium, vědu i výzkum. 1.1. Služby knihoven a) výpůjční služby

„ prezenční – informační zdroje je možné využívat v prostorách knihoven;

„ absenční – některé informační zdroje je možné si vypůjčit na  určitou dobu

i mimo prostory knihovny;

„ meziknihovní (meziknihovní výpůjční služba a  mezinárodní meziknihovní

výpůjční služba) – prostřednictvím knihovny je možné získat dokument, který

knihovna nevlastní. Knihovna jej objedná v  jiné knihovně v  ČR nebo v  zahrani

čí. Za  meziknihovní výpůjčky, zejména zahraniční, se zpravidla platí. Cirkulace

časopisů – knihovna, která nevlastní určitý časopis, může požádat jinou knihovnu

KnihovnicKé služby a informační zdroje

o pravidelné posílání časopisů poštou nebo o posílání obsahů časopisů a následné

posílání kopií článků;

b) rešeršní služby – prostřednictvím knihovny je možné získat rešerše z vlastních zdro

jů, katalogu, soupisu publikační činnosti, ale i ze zakoupených databází bibliografic

kých i faktografických; c) reprografické služby – tyto služby knihovny jsou placené. Je možné získat kopie

článků i technické zpracování autoreferátů; d) bibliograficko-informační služby – knihovníci poskytují informace o knihách, časo

pisech, pokynech pro autory, pořádají školení uživatelů atd.

Knihovny se organizují do  jednotlivých sítí. Kromě sítě veřejných, studijních a vědeckých knihoven fungují i další sítě odborných knihoven. Je to například síť zdravotnických knihoven, síť vysokoškolských knihoven a knihoven jednotlivých univerzit. Tyto sítě knihoven mají své ústřední knihovny, které se starají o společný nákup databází, budují souborné katalogy a zajišťují další odborné služby. V souborných katalozích lze získat informace o literatuře, která je v těchto knihovnách dostupná. Prostřednictvím internetu je možné se dostat i do katalogů velkých zahraničních knihoven a získat tak informace o knihách, které jsou v jejich fondech.

Příklady našich souborných katalogů:

Souborný katalog Národní knihovny – http://www.nkp.cz/

Souborný katalog Národní lékařské knihovny – http://www.nlk.cz/nlkcz/

Souborný katalog Univerzity Karlovy – http://ckis.cuni.cz 1.2. Informační zdroje Uživatelé knihoven a potenciální autoři by se měli seznámit s typy dokumentů, které jsou důležité pro jejich vědeckou a publikační činnost. 1.2.1. Informační prameny primární a) periodické zdroje: časopisy, periodika, seriály, noviny (mají ISSN – International

Standard Serial Number); b) neperiodické zdroje: knihy, monografie, učebnice, příručky, sborníky (mají ISBN –

International Standard Book Number); c) nestandardní literatura – diplomové, doktorské a habilitační práce, firemní literatura. 1.2.2. Informační prameny sekundární – bibliografie, rejstříky,

katalogy, databáze

Zejména pro publikační činnost je důležité rozlišovat typy dokumentů publikovaných v časopisech:

informační zdroje pro upŘesŇovÁní vÝzKumné hypotézy a vÝzKumného projeKtu

a) původní článek (original paper/article) – článek obsahuje původní, nové, dosud

nepublikované informace. Uvádí reference, tj. soupis pramenů, o něž se práce opírá

nebo z nichž autor vychází.

Obsah původního článku je obvykle členěn do  jednotlivých doporučených částí

uvedených v Uniform Requirements for Manustripts Submitted to Biomedical Jour

nals (viz použitá literatura):

1. titul, autorství, instituce a oddělení, adresa pro korespondenci, 2. abstrakt a klíčo

vá slova, 3. úvod, 4. metody a materiál, 5. etika, 6. statistiky, 7. výsledky, 8. diskuse,

9. reference (literatura); b) přehledový článek (review) – shrnuje dosavadní znalosti o  tématu. Čerpá z  dříve

publikovaných zdrojů, proto jsou v  tomto typu článku důležité reference, kterých

je obvykle větší množství (25 a  více). Přehledové články slouží k  rychlé orientaci

v problematice, časopisy s těmito články jsou obvykle často citovány; c) dopis redakci (letter to editor) – slouží k rychlé výměně názorů na publikovanou pro

blematiku. Obsahují komentáře, doplňující údaje a zkušenosti odborníků, může nava

zovat vyjádření autora původního textu. Uveřejnění dopisu v prestižním časopise se

svojí hodnotou může rovnat krátkému sdělení a je projevem odbornosti přispěvatele.

Dalšími typy dokumentů, se kterými se v  odborných časopisech setkáváme, jsou: předběžná sdělení (preliminary communication), krátká sdělení (short/rapid communication), souhrny (resumé), zprávy (report), recenze knih (book review) aj. 1.2.2.1. Elektronické informační zdroje Nejmodernějším typem dokumentů jsou v  současné době elektronické informační zdroje. Jejich vznik velmi úzce souvisí s rozvojem vědy a techniky v oblasti informačních technologií. Teprve po tom, co byla vyvinuta technologie elektronického záznamu a tato technologie byla dostupná většímu počtu lidí, mělo smysl uvažovat o elektronických dokumentech.

Některé dokumenty tohoto typu jsou pouze obdobou tištěných dokumentů, např. elektronické časopisy a  knihy, které jsou v  elektronické podobě naprosto totožné se svým tištěným vzorem. 1.2.2.2. E-knihy Elektronické knihy, též nazývané „e-books“, umožňují kromě zobrazení textového a obrazového obsahu i  navigaci. Stávají se stále populárnějším informačním zdrojem zejména v  akademických institucích díky tomu, že umožňují pohodlnější práci, která u  tištěných knih nepřichází v úvahu. Při práci s e-knihou oceníme možnost snadného vyhledávání částí textu, zvýrazňování nejdůležitějších částí textu, umísťování záložek pro snadný návrat do  určitého místa atd. Pracujeme-li s  více knihami, můžeme využít snadného přechodu z určitého místa jedné knihy do určitého místa knih dalších a informace porovnávat, což v podmínkách klasické (papírové) knihy vyžaduje poměrně náročnou manipulaci.

KnihovnicKé služby a informační zdroje

1.2.2.3. Databáze S  nástupem moderních technologií se objevily i  nové nástroje umožňující uchování informací, jejich snadnější dostupnost, třídění a hlavně vyhledávání. Jsou to databáze, které svým profesionálním zpracováním jsou jedním z  nejvýznamnějších elektronických zdrojů.

Databáze je vnitřně organizovaný soubor informací, jehož struktura umožňuje rychlé vyhledávání. Databázi vytváří producent, který může, ale nemusí, být jejím provozovatelem. Producent může databázi prodat databázovému centru (Dialog, STN International, Ovid, apod.). Databázové centrum nakoupí několik databází a  ty pak zpřístupňuje většinou všechny za  jeden poplatek, což přináší výhodu pro uživatele. Databázové centrum je komerční organizace, a  proto za  přístup do  jejich databází musíme platit. Kromě poplatku za  přístup se lze setkat i  s  poplatky za  čas strávený vyhledáváním v databázi a za tiskové výstupy, či výstupy zaslané na e-mail.

Dle obsahu dělíme databáze na všeobecné, specializované (vzácné tisky; patenty – SIGLE, WPI, EPO apod.), oborové (přírodní vědy a medicína – MEDLINE, EMBASE, INSPEC, Chemical Abstract, společenské vědy – ERIC, PSYCINFO) a  multioborové (Web of Science, PROQUEST apod.). Podle formy uchovávaných dat je dělíme na bibliografické (dokumentografické), faktografické a plnotextové.

Některé bibliografické databáze (např. Medline, Embase) jsou opatřeny odkazy na plné texty článků. Uživatelé, kteří si zaplatí licenci k plným textům (např. prostřednictvím bází Science Direct, SpringerLink), se prostřednictvím těchto odkazů dostanou na plný text článku.

Z  bibliografické (dokumentografické) databáze získáme přesnou a  úplnou citaci dokumentu, někdy i  s  abstraktem, což nám slouží jako podklad pro další hledání v jiných typech databází a informačních zdrojích. Tento druh databáze nám tedy neposkytne plný text dokumentu. Mezi bibliografické databáze řadíme např.: Biological Abstract, Chemical Abstract, Zoological Records.

Faktografická databáze, jak již vyplývá z názvu, obsahuje fakta. Tento typ databází se nejvíce uplatňuje v oblasti chemie a pro zpřístupňování statistických údajů. Dostaneme přesný údaj a  již nemusíme dohledávat primární dokument. Např. Beilstein, Gmelin, ASM Data.

Plnotextová (fulltext) databáze zpřístupňuje uživateli primární dokument v celém rozsahu. Za poplatek je možné si ho stáhnout nebo nechat zaslat e-mailem. Plné texty časopiseckých článků obsahuje např.: Science Direct, EIFL Direct, JSTOR, Proquest.

Dalšími hodnotnými a zajímavými elektronickými zdroji mohou být katalogy knihoven, portály, oborové informační brány, www stránky. Konkrétně u www stránek je ale dobré dát si pozor, protože jsou velice problémové z hlediska věrohodnosti vystavovaných dat. Často dochází k cíleným útokům na www stránky a znehodnocování jejich obsahu. Navíc, i když se tváří profesionálně, nemáte jistotu, že uváděné informace jsou pravdivé (oproti informacím v databázích, které jsou zpracovávány a ověřovány profesionály).

informační zdroje pro upŘesŇovÁní vÝzKumné hypotézy a vÝzKumného projeKtu

1.3. Impakt faktor, citační index a Hirschův index Při evaluaci institucí, akreditaci studijních programů, habilitačních řízeních apod. se objevují takové pojmy jako impakt faktor, citační index či nověji Hirschův index. Jde o pojmy ze scientometrie, kterými lze měřit a porovnávat výsledky vědecké práce jednotlivců i celých institucí. 1.3.1. Impakt faktor Vědecké časopisy mají různou kvalitu a vycházejí v různých jazycích a nákladu. Podle toho jsou také sledovány různým počtem badatelů, kteří z nich čerpají informace pro svou vědeckou činnost.

Impakt faktor (Impact factor, IF) se stal nejen měřítkem kvality a důležitosti odborných časopisů, ale také předmětem debat odborné veřejnosti o jeho významu, využívání, zneužívání a nadužívání při hodnocení vědecké práce.

Impakt faktor je definován jako poměr počtu citací z určitého časopisu, které byly zaznamenány v  hodnoceném roce na  všechny články publikované v  daném časopise za předchozí dva roky, k celkovému počtu všech těchto článků. Výsledek se uvádí na tři desetinná místa. Příklad:

Počet citací zveřejněných v roce 2009

na články vydané v letech 2007 a 2008

Impakt faktor časopisu za rok 2009 =

Počet všech článků vydaných v roce 2007 a 2008

1.3.1.1. Kde a jak hledat impakt faktor Journal Citation Reports (JCR) je unikátní specializovaná databáze poskytující kvantitativní nástroje pro sestavování pořadí, evaluaci a srovnání odborných časopisů. Nejdůležitějším sledovaným ukazatelem, ale samozřejmě ne jediným, je impakt faktor. JCR se dělí na  dvě části: 1. JCR Science Edition – postihuje oblast přírodních věd včetně zemědělství, techniky a  technologie, 2. JCR Social Sciences Edition zahrnuje tituly odborných časopisů z oblasti společenskovědních oborů. Databáze posuzuje jednotlivé tituly na základě citovanosti. Za pomoci JCR můžeme zjistit: 1. které časopisy jsou takto sledovány, 2. sledované časopisy podle oborů, země, nakladatele, 3. u jednotlivého sledovaného časopisu základní údaje o počtu článků a jak často a kým byly citovány, impakt faktor, index bezprostřední odezvy atd. Přístupná je od roku 1998.

JCR je součástí databáze Web of Knowledge (producent Thomson Reuters). Přístup je dnes možný z většiny vědeckých pracovišť, i když je placený.

Po  načtení úvodní stránky Web of Knowledge zvolíme odkaz na  “Journal Citation Reports”. Pak se nám zobrazí tabulka o  dvou sloupcích. V  levém, který se nazývá “Select a JCR edition and year”, vybereme buď “JCR Science Edition” nebo “JCR Social Sciences Edition” podle toho, v jaké oblasti chceme hledat, a následně nastavíme „rok“

KnihovnicKé služby a informační zdroje

(rozpětí je 1998–2009). Potom v pravém sloupci “Select an option” zvolíme zda chceme vyhledávat časopisy podle věcné kategorie, vydavatele nebo země původu  “View a group of journals by Subject/Category/Publisher/Country; Territory”. Také je možné přímo zvolit zadání názvu časopisu  “Search for a specific journal” nebo vybírat ze seznamu všech posuzovaných časopisů  “View all journals”. Po  vyplnění klikneme na “SUBMIT”.

Pokud jsme si vybrali vyhledávání podle věcné kategorie, vydavatele, země původu nebo názvu časopisu, načte se nám další formulář, ve kterém upřesníme naše požadavky (např. oblast, ve které chceme provést vyhledávání, nebo podle kterého analytického nástroje mají být výsledky řazeny  “View Journal Data – sort by: Journal Title, Total Cites, Impact Factor, Immediacy Index, Current Articles, Cited Half-life”; “View Category Data – sort by: Category Title, Total Cites, Median Impact Factor, Total Articles” atd.). Potvrdíme je “SUBMIT”.

Zvolíme-li možnost vyhledávání podle názvu časopisu, můžeme dále volit vyhledání dle plného názvu časopisu  “Full Journal Title”, dle zkratky názvu  “Abbreviated Journal Title”, slova z názvu  “Title Word” nebo ISSN. Volbu potvrdíme pomocí “SEARCH”.

Výsledky vyhledávání se vždy zobrazí ve formě tabulky s údaji o zkratkovitém názvu časopisu “Abbreviated Journal Title” (po kliknutí na zkrácený název časopisu dostaneme detailní informace o daném časopisu), ISSN, “Total Cites” (vypovídají o celkovém počtu citovaných článků v daném časopise za zvolený rok), Impakt Faktoru, “Immediacy Index” (rychlost citování článku z daného časopisu po jeho uveřejnění), “Articles” (celkový počet článků publikovaných v daném časopise za určený rok) a “Cited Halflife” (poločas citovanosti, tedy ukazatel vypovídající o tom, po kolika letech vzhledem k  aktuálnímu roku se objeví 50 % všech citací na  články daného časopisu v  citačních rejstřících).

Velmi příjemnou maličkostí navíc je nápověda při vyhledávání dle názvu časopisu umístěná ve  spodní části stránky. Ukazuje a  vysvětluje, jak máme formulovat náš požadavek, aby byl úspěšně zpracován. 1.3.2. Citační index Též citační ohlas, citační rejstřík jednoho konkrétního odborného článku je seznam prací, které se na tento článek odkázaly. Díky tomu, že sleduje citační ohlasy jednotlivých odborných článků, je primárním zdrojem informací pro stanovení IF.

Celosvětově nejznámější a  nejkomplexnější citační databází je americký produkt W